Metodología de laboratorio de diatomeas

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Desde Aïgos nos complace presentarles el siguiente artículo de la serie técnica de diatomeas escrito por Laura García Rivas. En esta ocasión, tratamos el tema de la metodología de laboratorio de la comunidad de diatomeas cuando el objetivo de la campaña es la determinación de la calidad del agua.

Esperamos que estos artículos reflejen nuestro compromiso con la investigación y los avances técnicos en el contexto colombiano. Esta metodología se desarrolló en base a protocolos internacionales que fueron adaptados a las condiciones observadas por Aïgos en los trabajos de campo en las cuencas de los ríos Bogotá, Magdalena y Cauca.

¿Cómo se preparan los portaobjetos y se cuentas las diatomeas en el laboratorio?

Una vez las muestras tomadas en campo llegan al laboratorio, se requiere de la preparación de los portaobjetos para su posterior análisis. Con el objetivo de llevar a cabo este proceso lo más rápido posible pero con el menor riesgo para el personal de laboratorio, se lleva a cabo el siguiente procedimiento:

  • Se toma una alícuota de la muestra y se la somete a un proceso de limpieza que consiste en centrifugarla para retirar el sobrenadante, eliminando el preservante.
  • Se adicionan 0,3 ml de HCl 37% y 5 ml de H2O2 30-33%. Esto se añade poco a poco con el objetivo de controlar la reacción.
  • Una vez que la reacción está controlada, se aumenta la temperatura (hasta 70-75°C) de las muestras para acelerar la digestión. Esto se puede llevar a cabo en baño de arena, baño María, digestor, etc.
  • Cuando la digestión ha finalizado, se añade 1 ml de HCl 1N.
  • Tras 1 hora, se limpian las muestras mediante sucesivos centrifugados y lavados. Se recomiendan 4 ciclos de 10 minutos de centrífuga a 1000 rpm seguidos de la retirada del sobrenadante y la adicción de agua destilada.

Durante la preparación de portaobjetos se debe evitar la contaminación cruzada mediante el uso de materiales independientes para cada muestra

Existen casos en los que la materia orgánica en la muestra es muy elevada, por lo que se requiere un ajuste del procedimiento para la digestión total de la muestra. En estos casos, se observa que en un momento dado, el proceso de digestión se detiene, lo que se observa por la ausencia de burbujas en la muestra. Esto puede indicar que el agua oxigenada se ha saturado o que la muestra ya no tiene materia orgánica para digerir. Por ello es importante realizar una verificación de la muestra en este punto para determinar si sigue existiendo material a ser digerido. En caso de que se observe que el proceso de digestión no está completado, se requiere un lavado de la muestra retirando el sobrenadante tras, al menos, 24 horas de decantación o mediante el centrifugado durante 10 minutos a 1000 rpm. Cuando ya se ha retirado el agua oxigenada, se procede a añadir, nuevamente, 5 ml de H2O2 30-33% para asegurar la digestión completa

¿CUÁL ES LA TEMPERATURA IDÓNEA PARA LA DIGESTIÓN DE LA MUESTRA?

En este sentido, existen “dos corrientes de pensamiento”, algunos expertos prefieren poner las muestras a alta temperatura (~100 ° C) para obtener una fuerte ebullición con el objetivo de asegurar una digestión completa y más rápida. En nuestro caso, preferimos dejar la temperatura justo por debajo de la ebullición fuerte de la misma (70 – 75 ° C en Bogotá) para disminuir la rotura de valvas con el burbujeo.

Tras el proceso de digestión, se procede al montaje de los portaobjetos permanentes. Esto se realiza colocando sobre un cubreobjetos una gota de la muestra a la que se le aplica calor para su evaporación. A continuación, se coloca en una placa de calentamiento una lámina portaobjetos con 1-2 gotas de Naphrax (Brunel Microscopios LTD, índice de refracción = 1.75) y se coloca el cubreobjetos con la muestra hacia abajo sobre la gota de resina. Una vez que comienza a burbujear se retira del calor y se aplica un poco de presión sobre el cubreobjetos con el objetivo de retirar todas las burbujas de aire. Finalmente, se deja secar el Naphrax para comenzar el recuento e identificación.
Cabe destacar que durante todo este proceso se deben utilizar materiales independientes para cada una de las muestras con el objetivo de evitar contaminaciones cruzadas entre muestras.

El recuento e identificación de la comunidad de diatomeas se realiza mediante el método de los transectos y se cuentan un mínimo de 400 valvas

En el caso de muestras con una alta concentración de sedimentos, se recomienda dejar reposar la muestra durante 30 segundos a un minuto antes de colocar la gota en el portaobjetos. El objetivo de esta acción es facilitar la sedimentación de este material que interferirá en el conteo en el microscopio.
El desarrollo de la metodología de recuento e identificación de diatomeas se basó en la norma europea UNE EN 13946:2014 (AENOR, 2014).
Para la determinación de la comunidad de diatomeas, se cuentan e identifican a nivel específico o infra específico un mínimo de 400 valvas por muestra mediante el método de los transectos. Este consiste en realizar barridos sobre el cubreobjetos siguiendo un transecto y contando todas las valvas que se encuentren en los campos que se observan.
Para la identificación y recuento se debe tener en cuenta:

  1. en caso de ver una vista pleural, se cuentan dos valvas,
  2. sólo se contabilizan las valvas que tengan, al menos, ¾ partes intactas,
  3. cuando no se pueda identificar las vistas pleurales a nivel de especie, se determinan a nivel de género, se identifican las vistas valvares en la muestra, y se reparten proporcionalmente las vistas pleurales de cada género entre las especies encontradas de dicho género,
  4. se recomienda el recuento de las 400 valvas de cada muestra en al menos dos portaobjetos diferentes que sean réplicas para asegurar que no ha habido errores durante el proceso,
  5. el contaje de la muestra se realiza de una sola vez,
  6. la identificación se realiza en base a bibliografía específica,
  7. se recomienda el uso del software OMNIDIA como apoyo a la identificación.

Hay que señalar que esta metodología ha sido desarrollada mediante la adaptación de protocolos internacionales a las condiciones del país, y por tanto, está en sintonía con la metodología desarrollada por el IDEAM y que será publicada, próximamente, en los Protocolos del Agua.
En un próximo artículo se estudiará la necesidad de contar 400 valvas en cada una de las muestras tomadas. Este análisis se llevó a cabo debido a la necesidad de determinar si las muestras con muy poco material diatomológico son viables para la evaluación de la calidad del agua en el país.

Bibliografía

AÏGOS, 2016. Implementación de la bioindicación en el Río Magdalena. Campaña de muestreo para el diagnóstico de las estaciones de la red y determinación de la calidad del agua. Informe final Diciembre 2016.
AENOR, 2014. Norma UNE EN 14407: 2014. Calidad del agua. Guía para la identificación y recuento de muestras de diatomeas bentónicas de ríos y lagos.

Autor: Laura García Rivas

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